水中大肠杆菌的检测方法

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一、Word完美格式附件 水中肠杆菌检测方法——多管发酵法 NIEA E201.54B 1、方法提要 本方法用于水中革兰氏染色阴性检测，不产生棒状需氧菌或并发菌。 厌氧菌，并能在351℃、48℃发酵牛奶3小时，检测产酸产气的大肠菌群（团）； 不同体积或不同稀释度的水样的结果以r 100 mL 表示 水中的最大可能数（MPN/100 mL）是指100 mL 水中大肠菌群的数量。 2 适用性本方法适用于地表水、地下水、废水、污水、水源水等水样中肠杆菌的检测。 3、干扰 (1)水样中含有抑制或促进大肠菌群生长的物质。 (2) 试验所用的玻璃器皿和设备含有抑制或促进大肠菌群生长的细菌

2.生长物质。 4. 设备 (1) 试管：100～1000 mL 试管。 (2) 吸管：10 mL 0.1 刻度灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量移液管：吸管()。 (3)试管：150×15mm左右的试管或带盖的螺旋试管。 (4)发酵管(tube)：尺寸约为22×9n的玻璃管。 (5)细稗瓶：可灭菌的硼硅玻璃制品，容量约100mL。 (6)锥形瓶：200～2000mL的可灭菌硼硅玻璃制品。 (7)取样容器：容量大于120mL的无菌硼硅玻璃瓶或带盖的无菌塑料容器，或市售无菌袋。 (8)冰箱：温度可保持在4±29。 (9)天平：虽然被测物体的重量大于2(?，但必须能够

3、精确称量至0.01g； 当被测物的重量不大于2g时，必须能准确称量到0.001go。 (10)培养箱：温度可维持在35℃。 (11) 高压灭菌器：温度可维持在121C(压力约15 lb/in2 或1.1 Kg/cm2)，杀菌15分钟以上。 精心整理学习帮手word完美格式（12）高温干热烘箱：如果用于玻璃器皿等器具的杀菌，温度必须保持在16（rc 2小时或170T 1小时以上。（ 13) 接种环：铂金或丝合金制成，适用于细菌接种或移植，也可使用无菌塑料制品 (14) pH 计：精度达到 0.1 个 pH 单位 五、试剂 (1) 试剂水：蒸灵水或去离子水，电导率小于2μmho/cm(nS/cm)(

4. 2) 培养基应为市售培养基。 1. 月桂基硫酸盐肉汤（简称LST） 1倍浓度LST培养基含有以下成分： 胰蛋白酶（） 乳糖（Lactose） 氯化钠（NaCl） 5.0g 磷酸氢二钾（KzHPO.） 2. 75g 磷酸二氢钾（KH2PO .) 2. 75g 十二烷基硫酸钠(Sodium lauryl sulfate) 试剂 水 20. 0g5. 将粉末溶解于1L试剂水中），完全溶解后，分取10mL于装有倒置发酵管的试管中，121X3灭菌15分钟，冷却备用，灭菌后培养

5、碱的pH值应为6.8±0.2。 灭菌后的培养基如当天不用，应在4℃±2C条件下保存，保存期为14天。 培养基可根据检验要求按配方配制。 2. green lactose bile broth（绿色乳糖胆汁肉汤，简称BGLB） 1升BGLB培养基含有以下成分： 蛋白脓（Peptone） 精心挑选的学习帮手 10.0gword perfect format 10.0g 乳糖（Lactose） 牛胆粉（牛胆粉） 20. Og 亮绿试剂（Bri 11 iant Green） 0.0133g 试剂水 IL 将 40 g BGLB 培养基粉末溶解在 1 L 试剂水中。 头发倒过来

6、发酵管的试管要用1219灭菌15分钟，然后冷却备用。 pH 值应为 7.2 ± 0.2。 灭菌后的培养基如不当日使用，应于4℃保存，保存期为14天。 培养基可根据试验需要按配方配制。 (三)无菌稀释液 1.磷酸二氢钾储备液称取磷酸二氢钾(K1LP0)3.4g，溶于50ml试剂水中。 完全溶解后，用1.0 N NaOH溶液调节其pH值7.2 0. 1，然后加入试剂水至100 mL，灭菌（过滤灭菌或121高温高压灭菌15分钟），冷藏保存以后使用。 4土2C贮存期为3个月。 2、氯化镁原液称取8.1g氯化镁(MgCL-6H20)，先用少量试剂水溶解，再加入试剂水至完全溶解。

7、定容100mL，灭菌后（过滤灭菌或1219高温高压灭菌15分钟），冷藏备用。 4土2C贮存期为3个月。 3、灭菌稀释液分别取氯化铁储备液10 mL、二氢二氢钾储备液2.5 mL，加试剂水定容至2000 mL，混匀，分装稀释瓶，12℃灭菌。 灭菌 15 分钟，作为无菌稀释液备用。 如果打算用于水样的稀释，灭菌后等分试样中的无菌稀释剂的体积必须为 90±2.0 mL。 4 2 C贮存期为3个月。 6、取样和保存 （1）盛放微生物检测水样的容器应使用干净、无菌的玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌取样袋，取样时应避免污染。如果水样中含有残留物氯气、适量无菌硫代硫酸钠（取自

8、取含氯废水时，加0.1mL。 每100mL水样加入10%硫代硫酸钠，可减少15mg/L的余氯。 取含氮饮用水样时，若每100mL水样中加入0.1mL 3%硫代硫酸钠，可中和的余氯约为5mg/L。）。 (2)取样前应清洁双手，然后取水样，水样应具有代表性。 精心整理学习助词的完美格式 (3) 水样在运输过程中温度应保持在10℃以下，不得结冰，实验室贮存温度应保持在4±2℃。 (4)水样应在取样后24小时完成假设实验的水样添加步骤(7、步骤(1)4.)，放入培养箱培养。 (5) 虽然水样必须足以完成要求的测试，但不得少于 120 毫升。 七、步骤测试分两个阶段进行，先走

9.推定测试。 如果推定测试的结果是肯定的，则进行第二阶段的确认测试。 如果结果仍然是阳性，则表明存在大肠菌群。 测试步骤如下： （一）假设测试 1. 小心选择发酵管内无气泡、无污染的10mL、2倍浓度LST试管。 2、水样在检测或稀释前必须用力摇晃25次以上，使样品充分混合，摇匀。 3. 根据水样中可能存在的微生物浓度，进行水样稀释步骤。 用无菌吸管吸取10mL水样加入90mL无种子稀释液中，形成10倍终释水样，混匀，再从10倍稀释液中稀释。 以相同的操作方法对水样进行100、1000、10000倍等一系列适当的稀释。 执行稀释步骤时，需要更换无菌稀释移液器。 水样稀释步骤见图1（注1）04，用无菌移液管

10. 取每个稀释度的水样10 mL 放入含有10 mL 2 倍浓度的LST 试管中，每个稀释度做5 管饮用水大肠杆菌检测方法，仔细混匀，混匀后发酵管不应产生气泡。 5、在35℃培养箱中培养48 3小时，观察并记录发酵情况，如有产气，则推定为阳性反应，如无产气，则推定为检测阳性。阴性反应，但如果培养基呈混浊状态，即使不产气，也应进行确证试验。 (2) 测定试验 如果推测试验的发酵管内有气体或混浊，使用BGLB 进行定性试验： 1. 仔细选择发酵管内无气泡且无气泡的BGLB 试管。没有被污染。 2. 用无菌接种环从产气混浊的LST培养基试管中接种一圈培养液到BGLB培养基试管中。 3. 在35±1C培养箱中培养48-3小时。 4 , 3 小 48

11、如果BGLB培养基试管内有气体，则判定试验为阳性反应。 八、结果处理 (1)确定BGLB试管为阳性反应后，按r 100 mL水中的最大可能数(MPN/100 mL)计算记录。 5个发酵管3个连续稀释液的MPN见表1。精心安排学习助词完美格式 (2) 表1所示接种水样体积分别为10mL、1.0mL和0.1mL。 如果使用了三个以上的稀释度，则取最有意义的三个稀释度 查表后，计算出100 mL水中肠杆菌的最大可能数量。稀释度的选择方法如下： 1. 先选择最高的稀释度5 支试管均呈阳性反应（此时所有稀释度较低的试管必须全部呈阳性反应），然后选择下两个稀释度（如表 2 水样不做 a）o2，如果稀释度为最多

12. 对于下组，如果5个试管都不是阳性，则选择稀释度最低的组，再选择接下来的两个稀释度（如表2中的水样b和c）。 3.如果按上述原则（1.和2.）选择3个稀释度后，下一个稀释试管组仍有阳性反应试管，舍弃原3组中稀释度最低的组并计入在接下来的稀释度数（如表2中的水样d）o4． 若按上述原则（1.至3.）选择3个稀释度，且较高稀释度的试管组仍有阳性反应试管，则将较高稀释度的阳性反应试管数加入对原 3 组中稀释度最高的组（如表 2 中的水样 e）计算如下：三个稀释度

13、犬水样体积小于100时，以整数表示（小数四舍五入）。 当菌落数大于100时，只取两位有效数字：如110用1.1×10?表示，16.000用1.6×10?表示。 (4) 试验记录必须注明取样时间、培养起止时间、培养基名称、培养板尺寸和各稀释度数据等相关数据。 九。 质量管理 （一）微生物取样人员和检测人员应具备微生物学的基本培训和知识。 (2)每批抽样应运空白。 (3)每批次或每10个水样需进行试剂空白试验。 (4) 新购培养基，每个批号必须与大肠杆菌阳性对照菌株（如大肠杆菌。

14. 运行测试以确保数据质量。 (5)如果一季水样中未检出大肠菌群，则必须用大肠菌群进行培养基试验，以保证数据质量。 (6)本方法培养的细菌可能具有传染性，检测后的培养基和器具应经高温高压灭菌。 10. and 井井有条的学习帮手词完美格式 11. 参考资料 (1) APIU. 2005. 水的方法和。 第 21 版，第 9221 节公共卫生，，哥伦比亚特区 (2) Difco &

15. BBL 手册：培养基手册。 2003. BD 系统。 如果水样需要稀释，建议稀释后30分钟完成检测步骤，以免造成细菌死亡或增殖，影响实验结果。 稀释倍数100Q，加水10000倍，加水10000倍。 取10倍稀释水样10mL，分入5支2倍浓度LT培养基试管中。 分为lOinL。 将10mL 1000倍稀释水样分入5管2倍浓度LT介质于基试管中，磁选10mL 10000倍脏水样分5管2倍浓度L

16. ST培养基碗形图1 水样稀释步骤表1 三个系列稀释（10 mL，1 mU 0.1 mL） 5支试管重复试验，MPN指数和阳性结果组合的95%置信区间 精心组织的学习辅助词perfect Format 阳性反应组合 MPN/100 mL95% 置信区间 阳性反应组合 MPN/100 mL95% 置信区间 lower limit upper limit lower limit upper limit 0-0--0-2216.840 表2 解释说明 水样类型 水样体积（mL ) 阳性反应组合结果(MPN/100mL)1010.10.010.001a5/55/52/50/50/55-2-04.9X102b4/55/51/50/50/54-5-148c0/51/50/50/ 50/5o- i-o2d5/54/54/51/50/54-4-14。 0X102e5/54/54/50/51/54-4-14.0X10精心整理学习助手